Isabella sinh vào ngày 22 tháng 4 năm 1451 tại Madrigal de las Altas Torres, Ávila, là con gái của Quốc vương John II và Vương hậu Isabella của Bồ Đào Nha. Bà được mô tả có dáng người khá bệ vệ và khỏe mạnh, nước da trắng sáng, mái tóc có màu trộn lẫn giữa màu dâu tây lai vàng và nâu vàng. Tuy nhiên, hầu hết các tranh chân dung vẽ bà đều có tóc màu ngăm đen.

Khi sinh ra, Isabella nằm thứ 2 trong danh sách thừa kế, chỉ sau người anh trai cùng cha khác mẹ là Henry IV của Castille. Henry khi đó đã 26 tuổi, dù đã kết hôn nhưng chưa có con. Ngày 17 tháng 11, năm 1453, em trai ruột của Isabella là Alfonso, Vương thân xứ Asturias sinh ra, nằm thứ 3 trong danh sách thừa kế sau chị là Isabella.

Năm 1454, Quốc vương John II thăng hà, Henry IV kế vị. Isabella cùng mẹ và em trai nằm dưới sự quản lý của Henry IV, không lâu sau họ chuyển ra sinh sống tại Arévalo. Điều kiện sinh sống của cả ba mẹ con rất tệ, vì anh trai bà Henry IV không tuân theo di mệnh của vua cha là đảm bảo cho 3 mẹ con không thiếu thốn về tài chính vật chất. Dù vậy, dưới sự chăm sóc của mẹ bà, Isabella vẫn được hưởng một chế độ giáo dục cao và có một lòng mộ đạo sâu sắc.

Từ khi sinh ra đến khi cuối đời, Isabella được nhận xét là vẫn giữ một nếp sống giản dị và có quy tắc. Và dù có đối lập rất hiển nhiên với Hồi giáo, phong cách ăn mặc của bà lại theo hơi hướng của người Moor.